Resistencia a la meticilina y producción de biopelícula en aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus coagulasa negativa en México / Methicillin resistance and biofilm production in clinical isolates of Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus in México

Resumen Introducción. Las infecciones por Staphylococcus aureus y Staphylococcus coagulasa negativa multirresistentes a los antibióticos y asociadas con la atención en salud tienen un gran impacto epidemiológico por su alta morbimortalidad; además, se han relacionado con la formación de biopelículas, lo cual también se asocia con la resistencia a los antimicrobianos. Objetivo. Determinar la resistencia a la meticilina y cuantificar la producción de biopelículas para establecer su posible relación con los aislamientos clínicos de S. aureus y Staphylococcus coagulasa negativa. Materiales y métodos. Se estudiaron 11 cepas de S. aureus y 12 de Staphylococcus coagulasa negativa. La resistencia a la meticilina se determinó con discos de cefoxitina tomando como valores de referencia los estándares del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) de 2018. La producción de biopelícula se cuantificó con cristal violeta. Los genes mecA e icaADBC se identificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se hizo un análisis bivariado con la prueba de ji al cuadrado y el coeficiente V de Cramér, utilizando el programa SPSS™, versión 20.0. Resultados. Nueve cepas de S. aureus fueron resistentes a la meticilina (SARM) y dos fueron sensibles. Ocho cepas de Staphylococcus coagulasa negativa fueron resistentes y cuatro fueron sensibles. El genotipo mecA se encontró en ocho de las nueve cepas de S. aureus y en seis de las ocho de Staphylococcus coagulasa negativa resistentes a meticilina. Todas las cepas formaron biopelícula. Diez cepas de S. aureus y 11 de Staphylococcus coagulasa negativa presentaron el genotipo icaADCB. No se encontró asociación entre la resistencia a meticilina y la formación de biopelícula. Conclusiones. La cefoxitina es suficiente para determinar el fenotipo resistente a meticilina y se asoció con el genotipo mecA. Las cepas resistentes a la meticilina y poseedoras del gen mecA pueden presentar un mecanismo de resistencia alterno. Los dos grupos de cepas formadoras de biopelícula se relacionaron con la presencia del operón icaADCB. La formación de biopelícula y la resistencia a la meticilina se expresaron como características independientes en los dos grupos de cepas.

Abstract Introduction: Infections associated with health care caused by S. aureus and coagulase- negative Staphylococci multi-resistant to antibiotics cause a high epidemiological impact due to their high morbidity and mortality. Biofilm formation, which has been associated with antimicrobial resistance, can also occur. Objectives: To determine methicillin resistance and to quantify the biofilm production to establish if there is a relationship in clinical isolates of S. aureus and coagulase-negative Staphylococci. Material and methods: A total of 11 strains of S. aureus and 12 of coagulase-negative Staphylococci were studied. Methicillin resistance was determined with cefoxitin discs and the Clinical Laboratory Standards Institute (CSLI), 2018 reference values. Biofilm production was quantified by the crystal violet method. The mecA and icaADBC genes were identified by PCR. A bivariate analysis was performed with chi-square (c2) and Cramér's V statistical tests, using SPSS™, version 20.0 software. Results: Nine S. aureus strains were methicillin-resistant and two were sensitive. Eight coagulase-negative Staphylococci strains were resistant and four were sensitive. The mecA genotype was found in eight of the nine S. aureus resistant strains and six of eight resistant coagulase-negative Staphylococci. All strains formed biofilms. Ten strains of S. aureus and 11 of coagulase-negative Staphylococci presented the icaADCB genotype. No association was found between methicillin-resistance and biofilm formation. Conclusions: Cefoxitin is enough to define the resistance phenotype and is associated with the mecA genotype. All strains formed biofilms and were related to the presence of the icaADCB operon. Biofilm formation and methicillin resistance were independent features in both groups of strains.

Degradación de ADN por micoplasmas en exudados faríngeos y vaginales, México / DNA Depletion byclinical isolated mycoplasmas, México

La limitada capacidad de biosíntesis de precursores esenciales en micoplasmas les ha permitido desarrollar mecanismos moleculares para su adquisición a partir de sus hospederos. Objetivo: Determinar la capacidad de degradación de ADN en micoplasmas aislados de exudados faríngeos y vaginales. Métodos: De las muestras clínicas de exudados faríngeos y vaginales se aislaron micoplasmas por método microbiológico y validaron por PCR. Las que resultaron positivas fueron evaluadas para determinar su capacidad de degradar ADN por método de formación de halo en agar. Resultados: La capacidad de degradar ADN a partir de los aislamientos clínicos de micoplasmas fue evidente y presentó diferencia significativa (P< 0,05) respecto a la cepa de referencia. Conclusiones: Los aislamientos clínicos de micoplasmas tienen actividad de ADNasas, implicando un papel importante para la adquisición de precursores de ácidos nucleicos, y condicionando alteración en las células hospederas.

The limited capacity of essential biosynthetic precursors mycoplasma enabled them to develop molecular mechanisms for acquisition from their hosts. Objective: To determine the ability of DNA degradation in mycoplasma isolated from clinical samples. Methods: From clinical samples of throat and vaginal swabs mycoplasmas were isolated by microbiological method and validated by PCR. The positive samples were evaluated for their ability to degrade DNA halo formation method on agar. Results: the ability to degrade DNA from clinical isolates of mycoplasma was evident and showed a significant difference (P <0.05) compared to the reference strain. Conclusions: Mycoplasma in clinical isolates have DNase activity, implying a role for the acquisition of nucleic acid precursors, and conditioning the host cells´ alteration.

Características patogénicas de cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos, asociadas con la formación de biopelículas / Pathogenic characteristics of Pseudomonas aeruginosa strains resistant to carbapenems associated with biofilm formation

Introducción. A escala mundial, se ha observado la aparición de cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes durante las últimas décadas. Este patógeno oportunista produce mecanismos de resistencia a diversos antibióticos. La resistencia a carbapenémicos en cepas de P. aeruginosa se ha asociado con la formación de biopelículas bacterianas, favorecidas por la presencia de exopolisacáridos (EPS) embebidos en una matriz extracelular y por la producción de los pili tipo IV (T4P). El objetivo de este trabajo fue evaluar la formación de biopelículas en cepas clínicas aisladas en el Hospital Infantil de México Federico Gómez de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, a través de la cuantificación de los expolisacáridos totales-reductores y su asociación con la expresión fenotípica de los T4P. Métodos. Se realizaron ensayos de susceptibilidad antibiótica por el método de Kirby-Bauer en 92 cepas clínicas de P. aeruginosa. Asimismo, se determinó la concentración mínima inhibitoria (MIC) para imipenem (IMP) y meropenem (MEM) por el método de dilución seriada en placas con agar con un replicador de Steers. La producción de metalo-β-lactamasas fue determinada mediante la técnica de difusión en disco y de sinergismo. Las biopelículas fueron realizadas en cepas clínicas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, a través de la cuantificación de cristal violeta, azúcares totales (antrona) y azúcares reductores (DNS), además de la expresión fenotípica de los T4P por la actividad de twitching motility . La diversidad genética de las cepas formadoras de biopelículas y productoras de azúcares reductores fue evaluada mediante la técnica de electroforesis de campos pulsados (PFGE). Resultados. El 30.4% (28/92) de las cepas de P. aeruginosa de origen pediátrico fueron recuperadas de la sala de cirugía y el 50% (46/92) de muestras de orina. Los resultados por Kirby-bauer mostraron que más de 50% de la cepas de P. aeruginosa fueron resistentes a 12 diferentes antibióticos. La MIC a los carbapenémicos fue de 64 µg/ml, con 43.1% (25/58) para MEM y 56.8% (33/58) para IMP. Así mismo, la producción de metalo-β-lactamasas fue observada en 43% (25/58) para MEM, 2% (1/58) para IMP y 12% (7/58) para ambas. Los análisis mostraron que 82% (48/58) de las cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos fueron altas formadoras de biopelículas. De éstas, 46.5% (27/58) mostraron concentraciones de EPS totales de 2000 a 6000 µg/ml y 27.5% (16/58) mostraron concentraciones de EPS reductores de 316 a 1108 µg/ml; además, 75% (44/58) de estas cepas mostraron actividad fenotípica de twitching motility . Conclusiones. La detección de azúcares totales, azúcares reductores y el fenómeno de twitching motility son factores que favorecen el desarrollo de las biopelículas en cepas clínicas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos. Los datos sugieren que estos factores están involucrados en la formación de biopelículas que confieren a la bacteria la capacidad para sobrevivir, persistir y colonizar a su hospedero.

Background. In recent years, the worldwide emergence of multidrug-resistant strains of Pseudomonas aeruginosa has been observed. This opportunistic pathogen produces mechanisms of resistance to several antibiotics. The resistance to carbapenems in P. aeruginosa strains has been associated with bacterial biofilm formation, favored by the presence of exopolysaccharides (EPS) embedded in an extracellular matrix and to the production of type IV pili (T4P). We undertook this study to assess biofilm formation in clinical strains of P. aeruginosa resistant to carbapenems isolated at the Hospital Infantil de Mexico Federico Gomez (HIMFG) through quantification of total-reducing EPS and its association with the phenotypic expression of T4P. Methods. Antibiotic susceptibility tests were performed using the Kirby-Bauer method in 92 clinical isolates of P. aeruginosa ; likewise, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined for imipenem (IMP) and meropenem (MEM) by the serial dilution method in agar plates with a Steers replicator. Production of metallo-β-lactamase (MBL) was determined by the disk diffusion method and synergism. Biofilm formation was performed in clinical isolates of P. aeruginosa resistant to carbapenems through the quantification of crystal violet, total sugar (anthrone), and reducing sugar (DNS), in addition to the phenotypic expression of T4P activity of twitching motility. The genetic diversity of strains forming biofilm and producing reducing sugars was evaluated by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Results. There were 30.4% (28/92) of P. aeruginosa strains of pediatric origin and 50% (46/92) of urine samples that were recovered from the operating room. The results using the Kirby-Bauer method showed that >50% of P. aeruginosa strains were resistant to 12 different antibiotics. The MIC to carbapenems was 64 µg/ml, with 43.1% (25/58) for MEM and 56.8% (33/58) for IMP. Likewise, MBL production was observed in 43% (25/58) for MEM, 2% (1/58) for IMP, and 12% (7/58) for both. Qualitative and quantitative analysis showed that 82% (48/58) of P. aeruginosa strains resistant to carbapenems were high biofilm formers using the crystal violet method. Of the high biofilm forming strains, 46.5% (27/58) showed concentrations of total EPS between 2000 and 6000 µg/ml and 27.5% (16/58) showed concentrations of reducing EPS between 316 and 1108 µg/ml. In addition, 75% (44/58) of these strains showed phenotypic activity of twitching motility. Conclusions. Detection of total sugars, reducing sugars, and the phenomenon of twitching motility are factors that promote the development of biofilms in clinical strains of P. aeruginosa resistant to MBL producers to carbapenems. Our data suggest that these factors are involved in biofilm formation, which confer bacterium with the ability to survive, persist, and colonize its host.

Identificación y tipificación de Haemophilus influenzae mediante PCR múltiple / Use of multiplex PCR for detection and identification of Haemophilus influenzae

Se diseñó una estrategia metodológica para la detección simultánea entre Haemophilus influenzae serotipo b (Hib) y no tipificable (HiNT), así como para discriminar entre H. influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pneumoniae. El estudio se realizó en una recolección de 64 cepas, las cuales se sometieron a amplificación por PCR utilizando ADN genómico o directamente el cultivo bacteriano como plantilla. La PCR se realizó en dos fases: 1) PCR triple para discriminar entre H. influenzae y M. catarrhalis empleando oligonucleótidos específicos para los genes del ARNr 16S y de la neumolisina (Ply) para identificar S. pneumoniae; 2) PCR doble para la identificación simultánea de Hib y HiNT, utilizando oligonucleótidos específicos de los genes cap y hmw. Se logró la amplificación del gen ARNr 16S en las 64 cepas de H. influenzae, sin obtenerse amplificación en las cepas control. La secuencia Bex A se amplificó en 29 de 32 cepas de Hib, y la secuencia HMWA se amplificó en 29 de 30 cepas de HiNT. La amplificación con los oligonucleótidos específicos para M. catarrhalis y S. pneumoniae no mostró productos con ninguna cepa de H. influenzae. Estos resultados permiten proponer la aplicación de esta herramienta metodológica para discriminar entre M. catarrhalis y S. pneumoniae, e identificar H. influenzae directamente a partir de muestras clínicas.

Perfiles proteínicos membranales de diferentes especies de Haemophilus / Outer membrane protein profiles of different species of Haemophilus

Actualmente se considera que el perfil proteínico membranal es una característica que puede contribuir a la clasificación de un microorganismo. En este tabajo se hace un análisis de los perfiles proteínicos membranales de Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius y Haemophilus paragallinarum, 3 especies del género Haemophilus que presentan semejanzas morfológicas, bioquímicas y genéticas entre sí y se comparan con los perfiles de Hemophilus parainfluenzae y Hemophilus parahaemolyticus, 2 especies con las cuales se han descrito semejanzas fenotípicas. Nuestros resultados sugieren que H. influenzae, H. aegyptius, y H. paragallinarum son 3 especies diferentes del género Haemophlus y no variedades de una sola especie

Posible producción de dos citotoxinas por una cepa de Escherichia coli / Possible production of 2 cytotoxins by a strain of Escherichia coli

Las citotoxinas VT y "Shiga-like" juegan un papel importante en la diarrea provocada por algunas cepas enteropatógenas de E. coli. Existe confusión acerca de que si estas dos actividades se deben a una sola toxina. Se empleó la cepa H30 de E. coli perteneciente al grupo 026 en la cual se describieron las dos actividades mediante una cinética de crecimiento tomando muestras a diferentes intervalos para observar su correlación con la actividad citotóxica, tanto en sobrenadante de cultivo como en lisado celular, probándola en cultivos de tejidos de células Hela y fibroblastos de ratón. Encontramos que en el sobrenadante la actividad citotóxica aparece en la fase logarítmica de crecimiento, mientras que la actividad en el lisado aparece hasta la fase estacionaria. Pensamos que se trata de dos citotoxinas diferentes producidas por la misma cepa, aunque es necesario profundizar en esta línea de trabajo